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LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼

时间:2021/3/18 17:35:19   作者:郑士利   来源:正势利   阅读:83   评论:0
内容摘要:霍夫曼调制对比度已经成为观察未染色,低对比度生物样本的标准。其创新的技术实施可大大简化操作,并具有更大的部署灵活性。将调制器集成在现代倒置显微镜的光路中,可以使用多种明场或相位物镜,而无需选择特殊物镜。现在,可以使用可自由访问的调制器分别修改和优化对比度。LEICAIMC(IntegratedModulationCon...
霍夫曼调制对比度已经成为观察未染色,低对比度生物样本的标准。其创新的技术实施可大大简化操作,并具有更大的部署灵活性。将调制器集成在现代倒置显微镜的光路中,可以使用多种明场或相位物镜,而无需选择特殊物镜。现在,可以使用可自由访问的调制器分别修改和优化对比度。
LEICA IMC(Integrated Modulation Contrast) 集成调制对比度

调制对比
调制对比度是宽视野显微镜中的一种对比度增强方法,可以将未染色样本和活细胞中的光学梯度或斜率转换为变化的光强度。它是由罗伯特·霍夫曼(Robert Hoffman)于1975年发明的,它采用狭缝板实现倾斜照明,并采用调制器进行光强度调制。由于标本的三维外观,调制对比技术在医学和生命科学中的主要应用是显微操作技术,例如IVF中的ICSI(胞浆内精子注射)以及转基因技术中的克隆和原核注射。

光路中的特殊组件
调制对比照明需要光路上至少有两个特殊组件。为了实现倾斜照明,在聚光镜的前焦平面上放置了一块狭缝板。其次,将调制器放置在物镜的后焦平面中。调制器包含三个具有不同光密度的指定区域:一个透明区域,一个具有15%的光许可和一个具有1%的光许可的区域。根据定义,通过调制器的光称为已调制。

除了上述组件之外,在滑板中通常还可以找到一个包含偏振片的第二缝隙。与位于显微镜聚光镜顶部的另一个偏振器结合使用,该偏振器可用于控制有效的狭缝开口(通过打开90°(暗)位置)并实现浮雕效果。请注意,样品不位于偏振片之间,因此可以使用双折射塑料或玻璃容器。但是,偏振片不是调制对比度的先决条件。
LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
图1:聚光镜的光线通过狭缝板的狭缝以倾斜照明。当光线通过样本时,光线在相变处发生偏转(例如质膜的斜率发生变化)。随后,光被偏转到调制器的不透明或透明部分,从而产生浮雕状的三维图像印象。

LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼


图2:当光通过调制器的不同区域时,其幅度被调制。通常,这些区域(从左到右)的透射率为1%,15%或100%。

调制对比度将相位梯度转换为亮度梯度
细胞的许多成分通过其固有特性引起透射光的相位变化。这些属性可能是特定结构的斜率和陡度,修改折射率变化率的结构或者只是给定结构的厚度变化的结构。由于这些特性(例如,单元厚度)通常会在某个区域逐渐变化(而不是立即变化),因此该区域上的光相位也会逐渐发生变化,从而导致相位梯度。相位梯度将使入射光发生衍射,从而导致光的偏转角发生变化。

由于调制对比度中采用了倾斜照明,因此偏转角度的变化可能会受到很大影响,并且与非偏转光相比,光将在不同区域通过调制器。在所得到的图像中,以斜率,陡度,厚度等变化的程度或多或少均匀的单元区域将显示为灰色。对于图像的背景也是如此,因为通过这些同质区域的光不会由于样品中的相位梯度而经历相移,并且几乎不会偏转。

在调制对比系统中,未偏转的光以15%的光许可通过调制器中的区域,从而导致单元和背景的均匀区域呈灰色。当光通过导致相移(例如,细胞膜斜率变化)的标本区域时,光会偏转到调制器的黑暗区域(允许1%)或透明区域(允许100%)。当样品倾斜照射时,图像从渐变的一侧显得较暗(在允许1%的允许下,光被偏转到该区域),而从渐变的另一侧(该光线被偏转到有1%的区域)显得更亮。 100%的权限)。

LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
图3a,b:通过将相位梯度转换为亮度梯度,调制对比度可视化了透明的低对比度样本。结果,形成了高对比度的灰度级,产生了三维图像的印象。

IMC提供更多自由
在使用集成调制对比度(IMC)的情况下,调制器集成在物镜外部的焦平面中,该焦平面与光束路径中的聚光镜(中间光瞳)共轭(图4)。调制器安装在滑架上,滑架插入到支架侧面的瞳孔间接口中(图5)。因此,它们是可自由访问的,并允许用户根据需要轻松调整对比度。除此之外,还可以使用具有不同传输的调制器。滑块还具有用于未调制图像的明场位置。已设置带有IMC的显微镜,以确保所有物镜的对比度方向(3D压印的阴影方向)相同。因此,当改变物镜或放大倍率时,标本的空间印象保持不变。
LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
图4:Leica Microsystems倒置数码显微镜中的IMC解决方案。调制器可在物镜外部自由访问,并位于中间瞳孔中,可灵活调节。狭缝隔膜位于聚光镜瞳孔中。

LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
图5:在两个不同瞳孔位置带有调制器盘的IMC滑块易于使用,并且可以进行单独调整。

解耦调制器时的基本考虑是,物镜的后焦平面可以在45 mm共焦距离的整个范围内的任何位置。因此,物镜外部的调制器必须至少可移动该距离。得益于徕卡物镜的设计,该物镜由固定焦平面,倒置显微镜中的展开以及从5x到63x的固定放大倍数确定,因此可以将调制平面的数量减少到两个光瞳位置(图6)。

到瞳孔图像的光束路径,即所谓的中间瞳孔,被设计为1x望远镜系统。物镜后面的无限光路在中间瞳孔中再现。结果,在不损害图像的位置或质量的情况下,任何厚度的平行于平面的光学调制器也可以在中间光瞳处插入光束路径,倾斜或倾斜。通过观察筒的单色和彩色校正以及IMC调制器的气相沉积灰色和深色金属涂层的极低反射特性,可将杂散光和假光降至最低。

LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼
图6:徕卡物镜由固定焦平面定义。由于它们在倒置显微镜中的使用以及由于5x-63x的固定放大倍率,可以将调制平面的数量减少到两个光瞳位置。

个别可变参数
IMC为单独调整调制对比度提供了很大的范围。调制器可垂直调节,以始终提供均匀的图像。因此,可以补偿不同阶段或缓冲溶液水平以及标本皿内细胞的不同位置。侧向移动调制器会改变分辨率:调制器和狭缝光阑向外移动得越远,分辨率就越高(最大分辨率Res =λ\ 2NA)。

有两个调制器参数会影响对比度的强度:透射率和灰色区域的宽度。降低透射率会增加对比度。例如,25%的透射率可产生平滑的对比度。值为10%左右时,对比度会变得更加清晰。改变调制器宽度同样有效(图7)。
LEICA集成调制对比(IMC)光路——霍夫曼


图7:横向可调的调制器,分辨率可变,狭缝光阑带有额外的偏振狭缝,可调节浮雕效果。



缩小灰色区域可产生更清晰的对比度,而宽的调制器则可以减轻整体图像的印象。IMC的裂膜具有两个开口。第一狭缝成像在调制器的灰色区域,从而产生用于调制对比度的倾斜照明。第二个狭缝被偏振箔覆盖(图7)。位于光圈前面的可旋转偏振片可以增加或减少调制对比度的3D效果。使用塑料皿时,偏振器不会影响图像质量,因为光仅在照明侧偏振,而在物镜侧不使用检偏镜。狭缝隔膜的尺寸与最常用的聚光镜相匹配。

因此,IMC不仅适用于生物材料的常规检查,而且还是要求苛刻的应用(如显微操作,显微注射或显微解剖)的出色工具。



IMC的优势
许多优点使集成调制对比度成为广域显微镜中广泛使用的方法。集成的调制对比度允许使用放大倍数高达63倍的物镜。不需要特殊的物镜,可以将具有较高校正度的物镜(例如,平消色差和复消色差物镜)用于调制对比度。这样可以提供出色的分辨率,并具有良好的对比度和可见度

调制对比显微镜的另一个优点是,与微分干涉对比显微镜不同,可以使用塑料容器和皿,因为光路中的偏振器位于样品之前。此外,不需要沃拉斯顿棱镜。这为配备调制对比度的显微镜带来了适中的成本。



标签:集成 调制 对比 











 




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