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光学设计ZEMAX

关于普通光学显微镜和扫描光学显微镜的空间分辨率问题

时间:2015/4/27 22:11:36   作者:郑士利   来源:正势利   阅读:641   评论:4
内容摘要:    所谓普通显微镜,就是指宽场成像显微镜,所谓宽场成像就是“面成像”,所谓面成像就是一个时间点获得一整个二维图像,这是与明显区别于扫描成像显微镜的。扫描显微镜是“点成像”,即每个时间点只能获得一个空间信息,通过不断花费时间去扫描最终获得整个二维或三维图像,因此扫描成像每个像点...
    所谓普通显微镜,就是指宽场成像显微镜,所谓宽场成像就是“面成像”,所谓面成像就是一个时间点获得一整个二维图像,这是与明显区别于扫描成像显微镜的。扫描显微镜是“点成像”,即每个时间点只能获得一个空间信息,通过不断花费时间去扫描最终获得整个二维或三维图像,因此扫描成像每个像点不是一个时间点,不管扫描速度有多快。不过目前市场的碟片共聚焦,属于二者综合性,因为使用多孔碟片,在一个时间点就可以多获得几个空间点信息,但是整个图像也不是一个时间点到,部分空间信息是一个时间点到。
    简单的说,宽场和单光子扫描共聚焦光学显微镜,都受衍射极限限制,横向分辨率极限基本都是200nm左右(可能有人说共聚焦横向分辨率也会提高,但我个人认为就算提高也是非常有限的,共聚焦的核心是针孔,针孔的核心作用是去除不同激发焦深杂散荧光,可以有效的提高纵向分辨率)。但是双光子扫描显微镜由于其特殊的荧光激发机理,分辨率可突破衍射极限(补充一点双光子显微镜不用共聚焦,即双光子扫描显微镜,而不是双光子共聚焦显微镜)。
由于是显微系统成像,因此分辨率还跟物镜数值孔径、放大倍数、成像CCD有关。比如对于宽场成像,在100×物镜下,要想有效实现200nm的分辨率,根据奎斯特取样定理,ccd单个像素是不能大于10um的,否则分辨率就受限于单个物理像素大小了。
    对于扫描成像系统来说,成像分辨率取决两个部分,一个是聚焦光斑的大小(与物镜的数值孔径有关),另一个是扫描时候的步进精度有关。并不是说扫描像素越多分辨率越高,即100×100图不一定比1000×1000的图像分辨率要低,买仪器的时候不要被忽悠了。什么叫做好,就是同样尺寸大小的图,扫描出像素多就是分辨率高,如一个实际大小是1cm×1cm的图,100×100的分辨率肯定比1000×1000的差。
    显微镜分辨率最多也只能达到光波长的一半——自然光的平均波长为0.55µm,所以分辨率能达到0.275 µm,最好的光学显微镜能把物体放大2000倍,这是细菌的量级。要想继续看小下去,必需质的飞跃。光学显微镜的分辨率就被套上了极限枷锁。即使透镜组合被制作得无可挑剔,分辨率最多也只能达到光波长的一半。自然光的平均波长为0.55µm,这就是为什么光学显微镜最多只能分辨0.275 µm的细节。
    若想继续用可见光做显微镜的光源,必须缩短它们的波长,唯一的办法是让光跑得更快
    电子的速度能被电场加到特别大,以至波长缩到光子的1/100000。——这里存在疑问,为何速度快了,波长短?
今日,一般电镜分辨率已达1纳米,能将物体放大200万倍,如果再让电子疯狂加速,加上软件的帮忙,不到1埃(=0.1纳米)的原子也能分辨清楚;人可以分辨到0.2mm,光学显微镜0.2µm,电子显微镜0.2nm。
    补充一下,现在可见光波段已经可以绕过衍射极限实现十分之一波长,几十nm的分辨率了,比如sted,受激辐射光致漂白荧光显微镜技术。还有好几种方法都可以实现,只是主要还是科研上使用的多,条件比较苛刻:)而用x射线做显微成像,实验上能达到15nm,不过更困难一点要看到越小的物体,所需要的”放大镜”倍数要越大,放大镜本身也越大,要看到质子,中子,就需要加速器,对撞机了,要”看到”超弦这么小的物体,可能就需要银河系大小的加速器.当然,我们的宇宙本身就是一个巨大的放大镜,它把宇宙极早期的物质形态”放大”,通过星系结构,微波背景辐射而保留下来。











 




出处:正势利工作室

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