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显微镜

微镜技术原理(八)——各种显微镜检术介绍——正立式显微镜

时间:2012/12/2 19:48:00   作者:小利子   来源:正势利   阅读:1143   评论:3
内容摘要:第五章 各种显微镜检术介绍前面讲述了显微镜的光学原理以及附件,下面将分类介绍一下各类研究用镜检术。在生物研究领域,透射式明场显微镜得到广泛应用,在此基础上各种特殊的镜检方法也得到应用,如相衬,荧光,干涉,暗场,这些镜检方法在高档显微镜上均能同时实现,如OLYMPUS...

第五章        各种显微镜检术介绍

前面讲述了显微镜的光学原理以及附件,下面将分类介绍一下各类研究用镜检术。在生物研究领域,透射式明场显微镜得到广泛应用,在此基础上各种特殊的镜检方法也得到应用,如相衬,荧光,干涉,暗场,这些镜检方法在高档显微镜上均能同时实现,如OLYMPUS BX51 ,BX61.在此将分类介绍。

 

第一节  正立式显微镜

一.明视野观察(Bright field

明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式,广泛应用于病理、检验,用于观察被染色的切片,所有显微镜均能完成此功能。在此不再赘述。OLYMPUS 此类显微镜有CX31CX41等。参见图78

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           二.             暗视野观察(Dark field

暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同,不直接观察到照明的光线,而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此,视场成为黑暗的背景,而被检物体则呈现明亮的象。

 

暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象,微尘在强光直射通过的情况下,人眼不能观察,这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了体积,为人眼可见。

暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体,而是将光线改变途径,使其斜射向被检物体,使照明光线不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。

暗视野观察的分辨率远高于明视野观察,最高达0.02—0.004mm..

 

三.相衬镜检法(Phase contrast

在光学显微镜的发展过程中,相衬镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本.

  相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜如OLYMPUS CK40IX70等等。下图为OLYMPUS 正立式显微镜BX41+BX-PHD(相差聚光镜)。

微镜技术原理(八)——各种显微镜检术介绍——正立式显微镜

 相衬镜检法在装置上与明场不同,有一些特殊要求:

1.  环状光阑(Ring slit: 装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X20X40X100X等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。

2.  相板(Phase plate: 装在物镜的后焦平面处,它分为两部分,一是通过直射光的部分,为半透明的环状,叫共轭面;另一是通过衍射光的部分,叫“补偿面”。有相板的物镜称“相衬物镜”,外壳上常有“Ph”字样。

相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法,想要得到好的观察效果,显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面。

1.  光源要强,全部开启孔径光阑;

2.  使用滤色片,使光波近于单色;

 

四.微分干涉称镜检术(Differential interference contrast   DIC

 

   微分干涉镜检术出现于60年代,它不仅能观察无色透明的物体,而且图象呈现出浮雕壮的立体感,并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点,观察效果更为逼真。

1.  原理

微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等,光束分别在距离很近的两点上通过被检物体,在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小,而不出现重影现象,使图象呈现出立体的三维感觉。

2.  微分干涉称镜检术所需的特殊部件:

(1)       起偏镜

(2)       检偏镜

(3)       渥拉斯顿棱镜2

3.  微分干涉称镜检时的注意事项

1)因微分干涉衬灵敏度高,制片表面不能有污物和灰尘。

2)具有双折射性的物质,不能达到微分干涉衬镜检镜检的效果。

3)倒置显微镜应用微分干涉衬时,不能用塑料培养皿。

 OLYMPUS BX51+U-UCD 即可完成微分干涉镜检。下图是U-UCD

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     荧光镜检术

   荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。荧光镜检术广泛应用于生物,医学等领域。

 

1.荧光镜检术一般分为透射和落射式两种类型。

1)透射式:激发光来自被检物体的下方,聚光镜为暗视野聚光镜,使激发光不进入物镜,而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮,而高倍则暗,在油浸和调中时,较难操作,尤以低倍的照明范围难于确定,但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。

2)落射式:透射式目前几乎被淘汰,新型的荧光显微镜多为落射式,光源来自被检物体的上方,在光路中具有分光镜,所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用,不仅便于操作,而且从低倍到高倍,可以实现整个视场的均匀照明。

2.荧光镜检术的注意事项

(1)激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象,因此尽可能缩短观察时间,暂时不观察时,应用挡板遮盖激发光。

2)作油镜观察时,应用“无荧光油”。

3)荧光几乎都较弱,应在较暗的室内进行。

4)电源最好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。

目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜,如基因原位杂交(FISH)等等。

OLYMPUS BX41/51/+BX-FLA(荧光附件)或BX61+BX-FLA可完成荧光观察。请参见图11 BX-FLA和图12 BX61

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